建立一种超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定配方奶粉中生物素含量的方法.样品中加入生物素-D2作为同位素内标,经水超声提取后,以含体积分数0.1％甲酸的10　mmol/L乙酸铵溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾正离子模式、多反应监测方式进行定性定量分析.结果表明:生物素在1～50　ng/mL范围内线性关系良好,线性范围内对己知生物素含量样品3个标准添加水平的平均回收率为89.6％～93.1％,相对标准偏差为1.71％～4.33％.方法检出限为0.6　μg/100　g,定量限为1.5　μg/100　g,该方法具有灵敏度高、重复性好、分析时间短等优点,可以满足配方奶粉中生物素含量的测定要求.