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构建一个具有标记基因自动删除功能的穿梭质粒载体pZL-EGFP,用于快速准确地筛选符合临床试验要求的携带有外源目标基因的重组痘苗病毒MVA(rMVA).为构建pZL-EGFP,将原有穿梭质粒pSC11的标记基因由LacZ置换成EGFP基因,并在EGFP基因的两侧插入TKL的同源序列.pZL-EGFP与MVA病毒共转染BHK-21细胞后经10代传代,一次噬斑筛选以获得携带有外源基因且EGFP已被删除的rMVA.最终获得的rM-VA通过PCR和Western Blot方法对pZL-EGFP的功能进行鉴定.成功构建出具有标记基因自动删除功能的穿梭质粒载体pZL-EGFP,包装获得的重组痘苗病毒可在传代过程中自动删除标记基因EGFP.基因删除未影响重组病毒的活力,外源蛋白的表达具有良好的稳定性.pZL-EGFP能与MVA病毒在BHK-21细胞内发生同源重组并包装出rMVA,其携带的标记基因可在病毒传代过程中通过分子内同源重组被自动删除,基因删除不影响重组病毒的活力及外源基因的表达,这为进一步的研究奠定了坚实的基础.
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