目的：通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白（EH）的中试发酵工艺，为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法：首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线，然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500　L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的D600nm值、溶氧值（DO2）及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白；表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果：发酵结束时，上清中蛋白含量达1.41　g/L，经后期分离纯化，得到约21　g　EH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2×103±0.2×103，质谱分析相对分子质量约为7.3×103±0.73×103；Western印迹表明检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95%；凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512~1024　ATU/mg。结论：建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。