本发明涉及HPV16L2重组腺病毒疫苗的制备方法。其特征在于，所述腺病毒含有密码子优化型HPV16L2的核苷酸序列SEQ　ID　No：1，包括如下步骤：使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化重组腺病毒穿梭质粒pDC316，然后将回收片段和同样用内切酶EcoRI和HindIII双酶切的SEQ　ID　No：1所示的核苷酸片段连接，得到重组腺病毒穿梭质粒pDC316-HPV16L2；用制备的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染腺病毒包装细胞，得到携带有SEQ　ID　No：1所示的核苷酸序列的复制缺陷型重组腺病毒。所述病毒应用于制备预防和治疗HPV病毒引起的子宫颈癌以及食管癌的药物制剂。本发明产生良好的细胞免疫和体液免疫，得到良好的预防效果。