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本发明提供了构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体。该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能插入外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动插入的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，其还携带有两端带有同源序列的自删除标记基因系统。其序列为SEQ ID No.1。利用本发明中的穿梭质粒，可以方便快捷的构建出表达外源目的基因但不带有筛选标记基因的重组MVA病毒。利用本发明中的质粒载体构建的重组MVA病毒，能够满足未来临床试验的需求。为以MVA为基础的活病毒载体疫苗的研发奠定了前期基础。
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